Каталитический метод определения биологически активных веществ в биологических жидкостях и косметической продукции

Ю.Ю. Петрова, О.Ю. Ветрова, Е.Ю. Бырина, О.С. Долгушина, Ж.Б. Бажаева, К.С. Кокорина, Д.Р. Гимранов, Ю.М. Гимранова
Сургутский государственный университет ХМАО-Югры,
г. Сургут

Каталитические методы анализа отличаются высокой чувствительностью определения, как металлов-катализаторов, так и органических соединений, влияющих на их каталитическую активность. В данной работе в качестве аналитов были выбраны следующие биологически активные вещества: гистамин (биогенный амин), a-аланин (a-аминокислота) и коллаген (фибриллярный белок).

Гистамин - биогенный амин, образующийся в организме при декарбоксилировании аминокислоты гистидина под влиянием гистидиндекарбоксилазы, является одним из медиаторов, участвующих в регуляции жизненно важных функций организма и играющих важную роль в патогенезе ряда болезненных состояний. Гистамином пользуются фармакологи и физиологи для экспериментальных исследований.

Большинство α–аминокислот обладают широким спектром биологической активности. Например, ?-аланин участвует в метаболизме сахаров и органических кислот. Свободные аминокислоты, входящие в состав физиологических жидкостей, имеют важное функциональное значение. Изменение их концентрации часто связано с метаболическими нарушениями, которые свидетельствуют о развитии того или иного заболевания (сахарный диабет, остеопороз и др.).

Коллаген - фибриллярный белок соединительной и костной ткани, сухожилий, хрящей, обладающий свойствами стимулировать фибриллообразование и регенерацию повреждённых тканей. Коллаген широко используют как пластический материал в различных областях медицины и косметологии, а также в фармацевтической технологии в качестве основы, пролонгирующее действие лекарственных средств.

Широкое применение и биологическая активность гистамина, ?-аланина и коллагена в медицинской и фармацевтической практике обуславливает необходимость совершенствования способов их определения в биологических объектах и с целью аналитического контроля фармацевтической и косметической продукции. Известно достаточное число методов определения выбранных БАВ, некоторые из них избирательны и высокочувствительны. Так ИФА как чувствительный и простой по технике исполнения метод, несмотря на его ограниченные возможности по сравнению с хроматографическими методами, получил наибольшее распространение в лабораторной практике. Однако для многих из указанных методов можно выделить такие недостатки, как трудоемкость и/или дороговизна. Хроматографические методы, а также ультрафильтрация и электродиализ сложны для использования в клинико-диагностических лабораториях. Поэтому разработка чувствительной, селективной, простой и экспрессной методики является актуальной задачей, которая была решена с использованием каталитического метода.

Ранее [1] обнаружен ингибирующий эффект гистамина в реакции окисления гидрохинона пероксидом водорода, катализируемой медью(II), проводимой в растворе, и его активирующий эффект - на бумажных носителях. Наибольший активирующий эффект наблюдается на медьсодержащих бумажных фильтрах с химически привитыми гексаметилендиамино-группами. На основе теории о промежуточном активном комплексе сделано предположение о причинах ингибирующего и активирующего действия гистамина в реакции окисления гидрохинона пероксидом водорода. Выяснены оптимальные условия проведения реакции и разработана методика определения (3–9)·10^{-13 М гистамина} на медьсодержащих бумажных фильтрах с привитыми гексаметилендиамино-группами. Изучены правильность и селективность определения гистамина. Наибольшее мешающее влияние оказывают диэтиламин и триэтиламин. Методика использована для сорбционно-каталитического определения гистамина в слюне человека на уровне нМ. В анализируемом образце слюны, разбавленной в 10⁴ раз, найдено (3.55 ± 0.03)·10^{-9 М гистамина при норме содержания гистамина в слюне в свободном (не связанном с базофилами) состоянии 0.2–0.4 нг/мл, или (1.8–3.6) ·10-9 М [2].}

С целью повышения селективности определения нами был предложен гибридный вариант, в котором сочетается разделение методом бумажной хроматографии с последующим сорбционно-каталитическим определением непосредственно на бумажном носителе. Гистамин активирует каталитическую реакцию на фильтровальной бумаге в широком диапазоне содержаний на фильтре 10^-14 – 10^-1 мкмоль, в то время как в растворе в диапазоне концентраций от 10^-10 до 10^{-3 М наблюдали только ингибирование, а в отсутствие катализатора слабое собственное активирущее действие, усиливающееся в присутствии небольших количеств этанола. Были оптимизированы условия разделения гистамина на полосках фильтровальной бумаги и проведения реакции на них. В выбранных условиях предложена методика, которая позволяет определять гистамин в интервале концентраций 1·10-14} – 1·10^{-10 М из 2 мкл анализируемого раствора с с}_min7•10^{-15 М (с}_н 1×10^{-14 М,} s_r 0,03). Сочетание бумажного хроматографирования практически не влияет на чувствительность и воспроизводимость определения, но улучшает селективность определения, что позволяет определять гистамин в таких сложных препаратах как гистаглобулин, при этом белок не мешает определению, и в слюне (табл. 1).

Нами был выявлен активирующий эффект коллагена в реакции окисления 3,3’,5,5’-тетраметилбензидина персульфатом аммония, катализируемой медью(II), в растворе на уровне концентраций 10^-8 – 10^{-7 М. В оптимизированных условиях разработана методика определения коллагена в диапазоне концентраций 5,0}?10^-15 – 5,0?10^{-11 М (}s_r 0,02; с_min 2,3?10^{-15 М), отличающаяся высокой чувствительностью, воспроизводимостью и простотой аппаратурного оформления. Среди неорганических веществ наибольшее мешающее влияние оказывают Fе(II) и Co(II), а среди органических – витамин Е, ионол, ?-аминокислоты. Проведено определение коллагена каталитическим методом в креме (табл. 1).}

Весьма перспективна разработка сорбционно-каталитического метода определения a-аминокислот в сочетании с их предварительным разделением методом ТСХ. С этой целью в качестве индикаторной использовали известную реакцию восстановления железа(III) тиосульфатом натрия, катализируемую медью(II). Выявлен ингибирующий эффект a-аланина и оптимизированы условия проведения реакции на пластинах для ТСХ «Sorbfil». Получена градуировочная зависимость для определения a-аланина в широком диапазоне 5?10^-6 – 1?10^{-2 М. Однако, селективность предложенной методики низкая, так как другие} a-аминокислоты мешают определению 1?10^{-3 М} a-аланина на уровне концентраций 1?10^-8 – 1?10^{-6 М.}

Для повышения селективности определения коллагена и ?-аланина предложено сочетание их каталитического определения с методом ТСХ. Показано, что такой подход позволяет улучшить селективность определения: пороги мешающего влияния в варианте с ТСХ повышаются в 100 и более раз. Предложенные методики были апробированы в анализе косметической продукции (таблица).

Результаты определений гистамина, a-аланина и коллагена в слюне и косметической продукции каталитическим методом в сочетании с ПХ

Для выявления возможности определения флавоноидов кинетическими методами авторами ведутся работы по изучению кинетики реакции окисления 3,3',5,5'-тетраметилбензидина (ТМБ) периодатом калия, персульфатом аммония и пероксидом водорода, проводимой на различных носителях, в присутствии металлов переменной валентности Mn(II), Cu(II) и Fe(II). Проведен скрининг и выбраны следующие системы:

1) ТМБ - Cu(II) - персульфат аммония (либо периодат калия, либо пероксид водорода) на пластинах для ТСХ «Sorbfil» и на хроматографической бумаге;

2) ТМБ - Mn(II) - персульфат аммония (либо периодат калия) на пластинах для ТСХ «Sorbfi»l и на хроматографической бумаге;

3) ТМБ - Fe(II) - пероксид водорода на хроматографической бумаге.

Кинетические кривые для реакции ТМБ - Mn(II) - периодат калия) на пластинах для ТСХ «Sorbfil»: 1 – в отсутствие и 2 – в присутствии марганца

В оптимизированных условиях получены кинетические кривые (зависимости 1/R от времени, где R – зональный коэффициент отражения), демонстрирующие каталитическую активность Mn(II) и Cu(II) в индикаторной реакции (рисунок).

Список литературы

1. Ю.Ю.Петрова. Сорбционно-каталитический метод определения гистамина // Журн. аналит. химии. 2010. Т. 65. № 5. С. 538–547.

2. Боровский Е.В., Леонтьев В.К. Биология полости рта. М.: Медицина, 1991. 303 с. 

Назад к списку