Применение миноциклина с целью подавления активации микроглии на модели прогрессивной миоклонической эпилерсии первого типа in vitro

О. Окунева, И. Корбер, Т. Йенсу, А.Е. Лехесьеки, О. Копра
Красноярский государственный медицинский университет,
НИИ молекулярной медицины и патобиохимии,
г. Красноярск,

Университет Хельсинки, Центр Нейронаук, г. Хельсинки, Финляндия. Исследовалась эффективность антибиотика миноциклина гидрохлорида предотвращать активацию клеток микроглиальной природы при развивающейся прогрессивной миоклонической эпилепсии Унверрихта - Лундборга (первого типа). Заболевание наследуется аутосомно-рецессивно, вызвано миссенс-мутацией гена, кодирующего синтез фермента цистатина Б, ингибитора цистеиновых протеаз группы катепсинов, локализованных в лизосомах. Клиническая картина характеризуется прогрессирующими миоклоническими и тонико-клоническими судорогами, атаксией и медленно прогрессирующим ухудшением когнитивной функции, атрофией участков коры головного мозга, ответственных за моторные функции, и мозжечка. Кора головного мозга экспериментальной модели – Cstb^-/-мышей - характеризуется развитием микроглиоза в первые две недели развития, затем астроцитоза в возрасте одного месяца и впоследствии снижением числа нейронов, атрофией ткани и развитием симптоматического комплекса. В основу исследования положена гипотеза о том, что активированная на начальных этапах микроглия через синтез провоспалительных цитокинов запускает нейродегенеративный процесс, проявляющийся клинически. В качестве противовоспалительного препарата выбран полусинтетический антибиотик тетрациклинового ряда миноциклин, проявивший в ряде исследований эффект при нейродегенеративных заболеваниях.

Методы исследования. Объект – первичная культура микроглии, выделенная на пятые сутки жизни из коры головного мозга контрольных и Cstb^-/-животных. Клетки активировались липополисахаридом (ЛПС, 2,5 µг/мл) в течение 24 часов с предшествующей часовой инкубацией с миноциклином (1-50 µМ). Оценивались морфологические изменения (световая микроскопия), экспрессия фосфорилированной формы p38MAPK, активированной каспазы 3 (рр38МАРК, СС3, флуоресцентная микроскопия), синтез цитокинов (R&D Systems).

Результаты исследования. Нестимулированная ЛПС культура Cstb^-/- микроглии содержала в три раза больше (6,6 %, р=0,001) активированных, фагоцитирующих клеток в сравнении с контрольной культурой (2,2 %). Воздействие ЛПС приводило к активации 35 % Cstb^-/- микроглии и 25 % контрольных клеток. Преинкубация с миноциклином в концентрации 1µМ снижала патогенный эффект липополисахарида: число активированных Cstb^-/- клеток снижалось до 13 %.

Флуоресцентная микроскопия выявила, что 23 % исходной Cstb^-/- микроглии были СС3-иммунопозитивными (в контрольной группе – 15 %). Уровень рр38МАРК в исходном состоянии клеток не отличался между культурами, однако, воздействие ЛПС активировало до 30 % Cstb^-/- клеток, что в два раза превысило исходное значение (в контроле – 20 %). Миноциклин в концентрации 1-10µМ снижал число как СС3- и рр38МАРК-иммунопозитивных клеток в обеих культурах.

При измерении секреции клетками цитокинов оценено содержание 40 компонентов в среде инкубирования клеток. Нестимулированная Cstb^-/- микроглия обладала сниженной секреторной функцией, однако, при воздействии ЛПС резко увеличивалась секреция таких цитокинов, как интерлейкин-6, 1ra, 1а, и в большей степени таких хемокинов, как CCL 2, 3, 4, 5, обеспечивающих процесс хемотаксиса дендритных клеток, лимфоцитов, моноцитов в очаг поражения. Миноциклин не снижал, а, наоборот, потенциировал синтез цитокинов и хемокинов.

Выводы. Исходный физиологический статус Cstb^-/- микроглии морфологически активирован, но функционально подавлен, дополнительная стимуляция резко активирует оба параметра. Действие миноциклина противоположно направлено в отношении фагоцитирующей и секретирующей функций Cstb^-/- клеток. Результаты составляют основу для дальнейшего исследования особенностей физиологии Cstb^-/- микроглии и исследования эффективности миноциклина in vivo.

Список литературы

1. PennacchioLA.MutationsinthegeneencodingcystatinBinprogressivemyoclonusepilepsy (EPM1) / LA.Pennacchio, AE.Lehesjoki, N.Stone, VL.Willour, K.Virtaneva, J.Miao, E.D'Amato, L.Ramirez, M.Faham, M.Koskiniemietal. / Science, 1996, 271:1731-1734.

2. LehtinenMK. CystatinBdeficiencysensitizesneuronstooxidativestressinprogressivemyoclonusepilepsy, EPM1 / MK.Lehtinen, S.Tegelberg, H.Schipper, H.Su, H.Zukor, O.Manninen, O.Kopra, T.Joensuu, P.Hakala, A.Bonni, AE.Lehesjoki / J.Neurosci, 2009, 18:5910-5915.

Назад к списку